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MTT比色法注意事項

點擊次數(shù)：6729 發(fā)布時間：2021/8/9 11:25:14

MTT比色法注意事項

圣賓儀器科技上海有限公司

注意事項

1. 選擇適當?shù)眉毎臃N濃度和培養(yǎng)時間。

2. 設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基100ul、MTT10ul、二甲基亞砜100ul）。

3. 設(shè)置空白孔（細胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亞砜）。

4. MTT實驗吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系。

5. 96孔板邊緣32孔用無菌PBS填充，因為邊緣的32孔中水分蒸發(fā)很快，藥物易被濃縮，對實驗影響大。同時加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。

6. 防止藥物與MTT反應(yīng)。

如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是不需要的。

7. 吸收值分析

在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理的空白組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。

8. 培養(yǎng)過程中換液

100ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持50h以上，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果。如果培養(yǎng)時間長，在48h應(yīng)該換液一次。

9. 避免血清干擾

高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

10. 判斷污染

如加入MTT后都有個別孔立即變?yōu)樗{黑色，則污染的可能性極大。在加MTT可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。

11. 加DMSO要把液體小心吸掉

但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸去，可在這之先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法，懸浮細胞要離心2500rpm×10min.且其做MTThao用圓底型96孔板，清除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉。對于貼壁細胞，可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸。

12. MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了baozheng實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度zui好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般zui好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度chang期保存，避免反復凍融，zui好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心，有條件zui好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。
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